mRNA vakcina i genetička terapija

Gost na blogu Leon Vujanović

Ovo je jedan od najpopularnijih argumenata tzv. vaksoskeptika koji stavljaju znak jednakosti između mRNA vakcina i genetičke terapije, smatrajući da je integracija jednog u drugi molekul moguća, te da će rezultat takve interakcije proizesti katastrofalne rezultate. Što se toga tiče, oni su svakako u pravu. Efekti bi bili katastrofalni, ali zbog načina na koji se život razvijao mi znamo da je takav scenario jednostavno nemoguć. Da bismo zaista razumeli zašto je to tako onda moramo da sednemo u vremensku kapsulu i da se vratimo na sam početak.

Ovaj članak se ne bavi poreklom života već načinom na koji se on razvijao od nastanka pa sve do pojave DNK. Preteča prvih oblika života, za koje se već zna da su bili RNK su možda ironično, nežive tvari i put njihove evolucije od neživih ka živim se naziva abiogeneza. Oni koji se bave ovim istraživanjima imaju problem "kokoške i jajeta" jer se i dalje istražuje da li je RNK život stariji od metabolizma, ili obratno. Vidite, površina ovog kamena kog zovemo planetom Zemljom je nakon Big Benga bila preplavljena lavom. Termodinamika nam kaže da se toplota kreće od toplog ka hladnom i njeno isparavnje prema hladnom svemiru formiralo je najraniju atmosferu. Ona se veoma razlikovala od sadašnje i bila je nalik na onu koju vidimo kod gasovitih žinova poput Jupitera i Saturna. Činili su je vodena para (H2O) i jednostavni gasoviti hidridi metana (CH4) i amonijaka (NH3) i vremenom, kao posledica pomeranja tektonskih ploča i vulanskom aktivnošću nastaju ugljendioksid (CO2) i azotni gas (N2) i ovo je bitno spomenuti, pošto svi atomi koje sam naveo formiraju srž onoga što se zove primordijalna ili prebiotska supa.

Riboza je prost ugljikohidrat koji je osnova deoksiribonukleinske kiseline (DNK) i ribonukleinske kiseline (RNK). Jedna od mnogih razlika između DNK i RNK je odsustvo atoma kiseonika (na drugom ugljeniku DNK i odatle naziv de-oksiRIBOZA) između ova 2 molekula i zašto je to bitno ću objasniti kasnije. Znamo da je riboza činilac svih vrsti RNK, dakle i informacionog RNK, ali i adenozin trifosfata (ATP) koji je poznat kao "molekulska valuta" za intraćelijski transfer energije i ima ulogu baterije koja skladišti energiju koja je neophodna za pokretanje gotovo svih metaboličkih i biohemijskih procesa u našem organizmu. Sećate li se primordijalne supe? Pretpostavlja se da je život nastao u blizini geotermalnih otvora na dnu okeana zato što se u ovom okruženju može spontano generisati riboza reakcijom koja se zove formozna reakcija. Naime, gas metana se može, u prisustvu visokog pritiska, toplote i ugljen-dioksida hidrogenizovati u formičku/mravlju kiselinu (CO, OH, H) i formaldehid (CO, H, H), a pod visokim pritiskom i uz pomoć termalne energije se 2 molekula formaldehida kondenzuju u gliceraldehid, koji se spontano i uz prisustvo mineralnih soli, koje bi svakako bile prisutne na okeanskom dnu, sintetišu u ribozu. Veoma sličnom putanjom se mogu generisati i nukleinske baze u RNK (A, U, G, C) i drugi molekuli koji su formirali prvobitne oblike života. Danas ne postoje striktno RNK oblici života (osim RNK virusa, ali oni se zbog semantike ne smatraju živim bićima), međutim, ono što su nekada bili je, još od njihovog nastanka, milijardi godina kasnije i dalje očuvano u efektornim funkcijama RNK. Naime, ribozomi koji omogućavaju prevođenje RNK u biološke aktivne molekule, proteine, imaju RNK osnovu i enzimatsku (katalizatorsku) aktivnost. RNK se može autoreplicirati i individualni, ali i novi RNK lanci se po potrebi skraćuju ili produžuju. Neki od RNK enzima koji su i za nas bitni nalaze se unutar naših ćelija, odnosno u jednoj od ćelijskih organela - ribozomi i ako u njih zavirimo otkrićemo i ribozime. Oni su, kao i svi ostali enzimi katalizatori (ubrzavaju) biohemijskih procesa. Upravo je ovo mesto na kom se razne kombinacije tri RNK baze prevode u jednu aminokiselinu, čiji skup od desetak, stotinjak, više hiljada (itd) gradi biološki aktivne makro molekule, proteine.

Ni najveći geniji među nama nemaju širok kapacitet radne memorije i sa te strane se ne razlikujemo od prvobitnih oblika života, koji sada imaju potrebu za skladištenjem svih tih informacija. Šta smo postigli ako jedan korak unapred, a onda jedan korak unazad? Odavde proizilazi potreba za memorijom, odnosno molekularnim načinom pamćenja svih neophodnih informacija o proteinima, enzimima i svemu ostalom što nam je potrebno da zapamtimo sve neophodne informacije bez kojih ne bismo mogli da održavamo život, ali i da ono što smo naučili, prenosimo na potomke. Ova funkcija je delimično očuvana i u RNK, ali on je zbog svojih mnogih efektornih funkcija generalno nestabilan i ima skroman kapacitet pamćenja i ovim dolazimo do potrebe širenja tog kapaciteta, jer znanje je moć i što više znamo to smo bolji u preživljavanju, a sve što smo naučili možemo i preneti na potomke i na taj način obezbeđujemo kontinuitet, bez kog oni ne bi mogli da nastave ono što smo započeli, a to je nastanak i nastavak života od skupa najobičnijih atoma pa sve do onoga što poznajemo danas. Biološka organizacija komplikovanijih oblika života se kreće skupa individualnih atoma prema makromolekulima (ugljikohidrate, lipide, proteine i nukleotide) čija kombinacija formira ćelije, a one grade tkiva, tkiva organe i skup dva ili više organa čini sistem organa i sve je to zapakovano u jednom organizmu na koga deluje okruženje koje je takođe organizovano individualno i kolektivno i ništa se od ovog ne bi desilo da nismo evoluirali molekul koji će sve te informacije pamtiti, a to je DNK.

Prvi DNK oblik života zove se poslednji zajednički univerzalni predak od kog su, tokom različitog vremena, nastala tri široka domena života kakvog danas poznajemo: domen bakterija, domen arheja i domen eukariota u koji spadamo i mi i ovo znači da gotovo svi oblici života imaju više sličnosti nego razlika i to se može videti na primeru modelnih organizama poput C. elegans valjkastih crva, vinskih mušica i E. coli bakterija koji se ne bi koristili u prekliničkim studijama da je stepen naše međusobnih sličnosti nizak. Funkcije DNK su skromnije u odnosu na RNK, a to su pamćenje i prenos i međusobne razlike mogu najlakše objasniti kontrasnim poređenjem. Funkcionalna jedinica DNK je gen i skup svih funkcionalnih jedinica i nefunkcionalnih sekvenci se prenosi na potomke. Unutar jednog gena se nalazi varijabilan zbir slova nukleinskih kiselina: A, T, G, C. Slova koja su u RNK razlikuju se od onih u DNK samo po tome što se u njemima nalazi U, umesto T (više o tome kasnije). O DNK ne možemo da pričamo bez osvrta na njegovu dužinu. Zbog toga što je, u poređenju sa drugim domenima, domen eukariota najudaljeniji od univerzalnog pretka i naš DNK je duži, jer čuva više informacija odnosno sadrži više gena i nasumičnih sekvenci. Šta mislite, koliko je dugačak DNK koji se nalazi u samo jednoj ćeliji u bilo kom delu vašeg tela (izuzetak su jajna ćelije i spermatozoidi)? Znamo da molekul DNK čine dva linearna lanca slova i njega održavaju vodonične veze između AT ili GC nukleinskih bazi i ovo se zove jedan bazni par. Skup vodoničnih, ali i raznih nespecifičnih sila utiče na to da se DNK savija u prepoznatljiv oblik heliksa kog smo svi videli. Naš DNK broji nekih 3,200,000,000 baznih parova i u odsustvu kondenzacije bi se mogao razvući na 2-3m dužine, a s obzirom da se u našem telu nalazi oko 5x10^13 ćelija, onda je jasno da je prisutna veoma značajna kondenzacija i to je istina. Sav genetski materijal (izuzetak su jajne ćelije i spermatozoidi) se prvo kondenzuje u hromatin i obmotava oko proteina koji se zovu histoni i nekoliko nivoa organizacije kasnije (druga figura ispod objave) napokon dolazimo do hromozoma i ukoliko je deoba ćelija prošla kako treba, u svakoj ćeliji, osim polnih, biće prisutna 46 hromozoma, odnosno 23 homologna para hromozoma, od čega su 22 para telesni hromozomi, a poslednji par su polni XX/XY hromozomi. Neko bi pomislio da zbog toga što su naši organizmi komplikovane biomašine da je to slučaj i sa brojem naših gena. U realnosti, to baš i nije tako, jer obzirom da naš DNK nosi informaciju o 23,000-25,000 gena, veći deo našeg DNK nije funkcionalan, a i oko 8% svih sekvenci je virusnog porekla.

Moram da postavim jedno pitanje pre nego što počnem da odgovaram na pitanje o integraciji. Da li se DNK u ćelijama očiju razlikuje od DNK ćelija jetre, ili srca ili kože? Ne, DNK je isti u svim ćelijama. A zbog čega se onda ova tkiva razlikuju? Pa, zbog toga što je ekspresija gena visoko kontrolisan proces koji nije spontan nego se aktivira po potrebi tj na osnovu molekularnih i spoljašnjih signala. To znači da su u ćelijama jetre aktivni samo oni geni koji su uključeni u formiranje, rad i regulaciju ćelija jetre i funkcije organa jetre i ovo se odnosi i na ostale organe i tkiva. Ostatak DNK je isključen, odnosno postoji kao neaktivan u kondenzovanom obliku i te sekvence se nikada ne prevode u protein, jer za to nema razloga. Ovo se nikada ne menja, jer da je tako onda bismo najverovatnije izgledali kao džinovska amorfna masa nalik na teratomu. Način ekspresije gena se maksimalno pojednostavljeno odvija ovako: Prvo se enzimatski DNK prepisuje u informacioni RNK/mRNA. Ovaj molekul se mora dodatno modifikovati, jer sadrži sekvence koje se ne prevode u protein koje zovemo egzoni i oni se uklanjaju splajsovanjem. Zatim se na početak i kraj mRNA dodaje 5 'kapa na jednom kraju, što promoviše veći afinitet za prevođenje u protein na ribosomima nešto kasnije, i 3' poli-A rep, koji sprečava prevremenu degradaciju mRNA u citoplazmi. Konačno, sama mRNA se isporučuje izvan jezgra i ovo je jednosmeran put i on se nikako ne može integrisati u DNK, jer a) nuklearne pore koje odvajaju genetski materijal od ostatka ćelije su visoko regulisane i ovu barijeru mogu proći samo privilegovani molekuli ili poneki virusi, poput retrovirusa, herpesa, itd i b) RNK i DNK nisu strukturno kompatibilne. Pa šta bi se dogodilo da je to slučaj? Pa, da vidimo, i zanemarimo krajeve 5, 'i 3' na sekundu koji sprečavaju integraciju jer u DNK ne postoji komplementarna sekvenca i to bi je dovelo do pucanja.

⓵ DNK je kondenzovan i dok je u tom obliku, mRNA se ni na koji način ne može u njega ugurati i ta kondenzacija se jedino može raspetljati preko specijalnih enzima. Jedini RNK "organizam" koji je ovo u stanju da uradi je retrovirus i oni sa sobom nose enzim reverzne transkriptaze kojom svoj RNK umesto u protein, prepišu u komplementarni dvolančani DNK i uz pomoć enzima poput integraze uđu u nukleus i interišu se u DNK. Jedini retrovirus koji inficira ljude je HIV, ali ovaj virus je visoko specifičan za CD4 T limfocite i ne može ni na koji način inficirati ćelije u koje vakcinacijom ulazi mRNA iz vakcine.

⓶ mRNA je jednolančani molekul, a DNK je dvolančani molekul. Forsiranje jednog molekula u drugi bi tehnički napravilo ogromno abasično područije između 2 lanca, odnosno rupu dužine čitavog mRNA molekula, jer lanac u koji se nije integrisao ne bi imao s čim da se vodonično veže na mestima njenog nastanka. Abasično područije na nivou samo jednog nukleotida može biti potencijalno mutageno ili citotoksično, a mRNA molekuli uopšte nisu kratki. Npr, dve najimunogeničnije regije Spajk proteina su njegov sam početak, odnosno N-terminalna regija i S1 podjedinica na kojoj se nalazi receptor-vezujući domen (RBD) i specifičnije receptor-vezujući motiv. Ovaj motiv koga čini oko 70 amino kiselina je struktura kojom virus inficira naše ACE2 receptore. Obzirom da ne znamo koliko je dugačka mRNA sekvenca u vakcinama, pogledao sam NCBI i cela sekvenca Spajk proteina ima 1255 aminokiselina, a ono što nas zanima odnosno N-terminus, RBD i S1 su dugački nekih 515 amino kiselina. Zreo mRNA ima početak i kraj i te sekvence se zovu start kodon i stop kodon. Jedan kodon čini kombinacija 3 RNK nukleotida. Znači u najergonomičnijem slučaju mRNA u vakcinama se sastoji od 515 amino kiselina + start & stop kodon = 517. 517*3 je 1551, a s obzirom da samo jedna može potencijalno izazvati smrt ćelije onda je jasno zašto postoje mnogi regulatorni mehanizmi koji sprečavaju da do ovog dođe. Idemo dalje.

③ Šta bi se desilo kada bi i pored toga što je nemoguće naš informacioni RNK savršeno integrisali u naš dvolančani DNK? Da li smo zaboravili na to da se u RNK nalazi baza Uracil a u DNK Timin? Naš drugi drug, Citozin, je prisutan i u DNK i u RNK i zašto je sad on odjednom bitan? Ponekad se i pored toga što je kopiranje DNK izuzetno dobro regulisan proces, dogodi greška pri njegovom kopiranju spontanom deaminacijom (gubljenja -NH3 funkcionalne grupe ), čime se on pretvara u Uracil, a jedino po čemu se Uracil vizuelno razlikuje od Timina je dodatna metil (-CH3) grupa koja sprečava da se tokom reparacije i replikacije DNK on zameni u Uracil. Šta bi moglo da se desi samo nakon pojave jedne baze Uracila na nivou celog lanca DNK? U popravku te greške uključen je enzim Uracil-DNK glikozilaze koja ga poput molekularnih makaza izbacuje iz lanca i kada dođe do potrebe za deobom te ćelije, DNK polimeraza će, ukoliko je ta veza bila UA, na tom mestu u sekvenci u jednoj ćelij napraviti CG sekvencu, a u drugoj AT. Ovakve promene mogu, a i ne moraju da imaju negativan efekat po ćeliju. Ako se zamena desila u nebitnoj regiji onda se efekat nikada neće ispoljiti, a ako se desila u genu koji se često prevodi onda efekat tih mutacija može ili nemati nikakvog efekta ili može zaustaviti sintezu proteina u toj regiji i ukoliko se ovo desi na sredini proteina onda se biološka aktivnost tog proteina kompromituje i na taj način mogu nastati razne bolesti, uključujući i kanceri. Ono što je mnogo opasnije po integritet DNK lanca je mutacija (koja spontano nastaje deaminacijom koju sam spomenuo) UG i ona je često prisutna u kancerogenim ćelijama koje su to postale usled odsustva njene popravke. Na ovaj način se umesto paralelnih vodoničnih veza između 2 lanca formiraju unakrsne i ovaj oblik je izuzetno toksičan i može da omete jako veliki broj bioloških procesa i čija popravka zahteva kompletno razdvajanje 2 lanca i eliminaciju i zamenu svih isečenih sekvenci, jer u suprotnom može da dođe do lomljenja hromozoma ili ćelijske smrti koja se u ovom kontekstu naziva mitotička katastrofa.

I sve ovo bi bila posledica samo jedne integracije Uracila iz mRNA u DNK. Šta bi se desilo da je takva integracija u jedan od lanaca zaista i da se nakon vakcinacije formiraju abasične regije dugačke minimum nekoliko stotina nukleotida i to ne samo u jednoj, već u hiljadama ćelija? To je nemoguće zamisliti i ovo o čemu sam pisao je samo delić površno objašnjene liste, ali i pored toga mislim da govori dovoljno. Svako od nas je na ovoj planeti, od ovog momenta, pa do datuma rođenja proveo različit broj godina i retko ko od nas razmišlja o svim onim biološkim, biohemijskim, molekularnim i ostalim procesima koji se dešavaju nezavisno od našeg znanja ili uticaja. Razlog zašto je to tako je zbog toga što se u svakoj od naših 50,000,000,000,000 bez prestanka nastavlja priča koju je prvi put ispričao naš poslednji zajednički univerzalni predak pre nekih 3,6 milijardi godina.

Hvala na čitanju!

Ovo je tekst koji je napisao Leon Vujanović. Mislim da vredi da se pročita. Lično sam naučio puno čitajući.

Nadam se da će biti još tekstova.